Efetores no estudo da ferrugem do eucalipto
Carolina A. A. Hayashibara, Doutoranda em Genética e Melhoramento de Plantas - ESALQ/USP
Laboratório de Genética e Microrganismos “Prof. João Lúcio de Azevedo” – Departamento de Genética
carolina.h@usp.br
Identificação de efetores: uma estratégia promissora no estudo da ferrugem do eucalipto
Fungos são microrganismos eucariotos, que podem viver endofiticamente dentro de uma planta sem causar dano aparente (Azevedo et al. 2000), mas também existem aqueles fungos que causam algum tipo de dano às plantas, como é o caso do fungo Austropuccinia psidii (Beenken 2017). Este fungo é o causador da ferrugem das Mirtáceas, esse nome é devido aos sintomas da doença que dão aparência de ferrugem em folhas e frutos. A. psidii fungo ataca plantas da família Myrtaceae, como goiabeiras, jaboticabeiras, jambeiro e também o eucalipto. No eucalipto a doença acomete folhas e ramos jovens de plantas de até 2 anos de idade (Figura 1) ou na fase de muda. Esses danos causam perdas na produção, o que leva a perdas econômicas, já que a cultura do eucalipto fornece material para o setor energético (carvão vegetal), produção de celulose e setor madeireiro.
Figura 1. Sintoma da ferrugem do eucalipto: formação de pustúlas em folhas jovens.
A. psidii é um fungo biotrófico, ou seja, precisa de tecido vivo do hospedeiro para sobreviver, ter sucesso na infecção e colonizar seu hospedeiro. Nesse sentido ele utiliza de diferentes estratégias para vencer as repostas de defesa da planta. Assim, durante a colonização do hospedeiro o fungo libera moléculas chamadas efetores, que alteram a estrutura e a função das células do hospedeiro, facilitando a infecção ou suprimindo a resposta de defesa da planta (Hogenhout et al. 2009). Os efetores podem desenvolver funções no espaço extracelular ou intracelular em diferentes compartimentos celulares (Win et al. 2012), suas funções variam de inibição de proteases e quitinases, degradação de proteínas relacionadas à defesa, reprogramação transcricional e até mesmo interferência na secreção de proteínas (Göhre & Robatzek, 2008).
Para estudo de efetores, existem diferentes metodologias, que na maioria consistem na identificação dos genes candidatos a efetores de fungos a partir de dados de genoma e/ou transcriptoma, utilizando softwares de predição como o EffectorP (Sperschneider et al. 2018), ou na sua identificação a partir das características dessas proteínas efetoras, como: presença de peptídeo sinal, ausência de domínio transmembrana e superfície de ancoragem e proteínas com menos de 300 resíduos de aminoácidos (Lopes 2017). Após, essa predição chamada in silico, é feita a validação molecular por meio de RT-qPCR para avaliar a expressão desses genes in planta ou in vitro. Outro método comumente utilizado é a caracterização funcional desses candidatos a efetores por meio da expressão transiente. Por meio desta técnica pode-se detectar a localização subcelular destes candidatos, fusionando a proteína de interesse com o uma proteína verde fluorescente (GFP) em um vetor (plasmídeo), que é inserido por eletroporação em Agrobacterium tumefaciens e infiltrado nas folhas de Nicotiana benthamiana. Para visualização do sítio de localização do efetor associado à GFP é feita por meio de microscopia de fluorescência. Para tanto, pode ser utilizado o tecido epidérmico de folhas que são montadas em lâminas de vidro em tampão fostato. Posteriormente, as lâminas são analisadas ao microscópio de epifluorescência ou microscópio Confocal, podendo-se observar a proteína no núcleo da célula, por exemplo (Figura 2; Qi et al. 2019). Para detectar a translocação e a interação destes candidatos com proteínas das plantas pode-se utilizar os métodos de imunolocalização e coimunoprecipitação (Kemen et al. 2005; Win et al. 2011).
Figura 2. Proteínas candidatas a efetores marcadas com GFP, sendo expressas transientemente no núcleo de células de folhas de N. benthamiana. Fonte: foto adaptada de Qi et al. 2020.
Em relação a ferrugem do eucalipto, o estudo de efetores é um pouco mais complexo. Por serem biotróficos o fungo não desenvolve in vitro, ou seja, em meios de cultura no laboratório. Por isso é necessário a multiplicação dos esporos em tecidos vegetais, destacando o fato da interação fungo x planta ser mais complexa quando comparado ao estudo de fungos com outro estilo de vida (ex. necrotróficos). Atualmente, ainda não há estudos publicados sobre efetores de A. psidii, mas o grupo do laboratório de Genética de Microrganismos da ESALQ-USP, coordenado pela Profa. Maria Carolina Quecine, já identificou alguns candidatos a efetores (Lopes 2017) e vem trabalhando para caracterizá-los na interação de A. psidii com o eucalipto.
A identificação e a caracterização destes efetores podem ser aplicados futuramente no controle de doenças de plantas. Com esse conhecimento em mão, pode-se silenciar sua expressão, e até mesmo modificá-los para se tornarem ineficazes ou serem reconhecidos pelo sistema imune vegetal.
Referências:
Azevedo, J. L., Maccheroni Jr, W., Pereira, J. O., & De Araújo, W. L. (2000). Endophytic microorganisms: a review on insect control and recent advances on tropical plants. Electronic Journal of Biotechnology, 3(1), 15-16.
Beenken, L. (2017). Austropuccinia: a new genus name for the myrtle rust Puccinia psidii placed within the redefined family Sphaerophragmiaceae (Pucciniales). Phytotaxa 297:53-61.
Gohre, V., and Robatzek, S. (2008). Breaking the barriers: Microbial effector molecules subvert plant immunity. Annual Review of Phytopathology 46: 189-215.
Hogenhout, S. A., Van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., and Kamoun, S. (2009). Emerging Concepts in Effector Biology of Plant-Associated Organisms. Molecular Plant-Microbe Interactions 22:115-122.
Kemen, E., Kemen, A. C., Rafiqi, M., Hempel, U., Mendgen, K., Hahn, M., and Voegele, R. T. (2005). Identification of a protein from rust fungi transferred from haustoria into infected plant cells. Molecular Plant-Microbe Interactions 18:1130-1139.
Lopes, M. S. (2017). Identificação in silico e perfil transcricional de genes candidatos a efetores de Austropuccinia psidii. Dissertação. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba, Brasil.
Qi, M., Mei, Y., Grayczyk, J. P., Darben, L. M., Rieker, M. E., Seitz, J. M., ... & Link, T. I. (2019). Candidate effectors from Uromyces appendiculatus, the causal agent of rust on common bean, can be discriminated based on suppression of immune responses. Frontiers in Plant Science, 10, 1182.
Sperschneider, J., Dodds, P. N., Gardiner, D. M., Singh, K. B., & Taylor, J. M. (2018). Improved prediction of fungal effector proteins from secretomes with EffectorP 2.0. Molecular plant pathology, 19(9), 2094-2110.
Win, J., Kamoun, S., and Jones, A. M. (2011). Purification of effector–target protein complexes via transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant immunity: methods and protocols 712:181-194.
Win, J., Chaparro-Garcia, A., Belhaj, K., Saunders, D., Yoshida, K., Dong, S., Schornack, S., Zipfel, C., Robatzek, S., and Hogenhout, S. (2012). Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. Pages 235-247 in: Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology Cold Spring Harbor Laboratory Press.